Um die unterschiedlichen Formen der CDGs besser zu verstehen und dadurch besser erkennen und behandeln zu können, ist es sehr wichtig, die genauen Details der verschiedenen Glykosylierungswege und ihre Zusammenhänge zu untersuchen.

Um diese Details sowohl auf der molekularen und zellulären Ebene als auch im ganzen Organismus zu erforschen, haben wir ein Team von Experten in unterschiedlichen Forschungsbereichen (N-Glykosylierung, C- und O-Mannosylierung, Struktur- und Lipid-Biochemie, Proteomik, Glyko-Proteomik, Glykomik, Lipidomik und Entwicklungsbiologie) aus ganz Deutschland zusammengestellt.

Unsere gemeinsame Vision ist es, durch unsere Zusammenarbeit einen tieferen Einblick in die Glykosylierungsprozesse zu erhalten und dadurch den behandelnden Ärzten bessere Diagnosewerkzeuge und Therapiemöglichkeiten für die Erkrankten an die Hand zu geben.

Unsere Expertenteams sind auf insgesamt vier Standorte verteilt: Universität Heidelberg (Britta Brügger, Thomas Ruppert, Irmgard Sinning, Sabine Strahl), Universität Frankfurt (Harald Schwalbe), Medizinische Hochschule Hannover (Hans Bakker, Falk Büttner) und das Max Planck Institut in Magdeburg (Erdmann Rapp).

 

Teilnehmende Arbeitsgruppen

 

Hans Bakker, Medizinische Hochschule Hannover

„C-Mannosylierung von Proteinen im endoplasmatischen Retikulum und die Bedeutung in Zielproteinen“

Proteinmodifikationen durch Zucker spielen eine wichtige Rolle in der menschlichen Entwicklung. Folglich können Störungen im Zuckerhaushalt schwere negative Auswirkungen auf den Gesundheitszustand des Körpers haben. Aufgabe der Forschergruppe FOR2509 ist es diese Störungen genauer zu erforschen um mögliche Therapieansätze zu entwickeln. Als Teil dieser Forschergruppe konzentriert sich unsere Arbeitsgruppe um eine besondere Art der Proteinmodifikation, die C-Mannosylierung.

Die C-Mannosylierung umfasst die verknupfung  eines Kohlenstoffatoms (C) mit dem Zucker Mannose, welche bislang noch kaum erforscht ist. Erste Forschungsergebnisse lassen einen Einfluss der C-Mannosylierung auf den Bau und die Stabilität bestimmter Proteine vermuten, wie beispielsweise bei Proteinen der Immunabwehr. In den Grundbausteinen des Körpers, den Zellen, wird die Mannose von spezifischen Enzymen erkannt und während des Zusammenbaus der Proteine aus deren Einzelbestandteilen (Aminosäuren) auf diese übertragen. Es wird vermutet, dass während der Übertragung der Mannose anstelle von einem mehrere Enzyme miteinander wechselwirken. Ziel unserer Arbeitsgruppe ist es daher diesen Prozess genauer zu untersuchen und Wege zu finden auftretende Störungen behandeln zu können. Ein weiteres Ziel ist die Untersuchung von vollständig zusammengebauten C-mannosylierten Proteinen, welche sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zelle wichtige Aufgaben übernehmen. Fehlerhaft C-mannosylierte Proteine sollen so schneller erkannt werden um weitere Auswirkungen auf den Körper zu vermeiden.

Mehr Informationen zu Hans Bakkers Arbeitsgruppe auf seiner Website.

Britta Brügger, Universität Heidelberg (BZH)

„Protein-Lipid-Wechselwirkungen: Der Einfluss von Lipiden auf zelluläre Glykosylierungsprozesse“

Glykosylierungsreaktionen in der Zelle finden in direkter Umgebung von Membranen statt, die zum einen die Zelle nach außen abschirmen und zum anderen verschiedene Reaktionsorte in der Zelle voneinander trennen. Hauptbestandteil der Membranen sind Proteine und Lipide. Lipide, auch als Fette bezeichnet, stellen eine sehr diverse Gruppe von Biomolekülen dar, die sich ganz allgemein durch ihre schlechte Löslichkeit in wässrigen Lösungen auszeichnen. Während Lipide lange Zeit nur als Gerüststrukturen von Membranen betrachtet wurden, scheinen sie jedoch darüber hinaus viele zusätzliche Funktionen zu erfüllen, die wir in vielen Fällen im Detail noch nicht erkannt bzw. verstanden haben.

Unser Projekt hat zum Ziel, die Rolle von Lipiden bei Glykosylierungsreaktionen zu verstehen, d.h.: Welchen Beitrag liefern welche Lipide zu verschiedenen Glykosylierungsreaktionen? Wie ist diese Funktion der Lipide im Falle einer Glykosylierungsstörung verändert?

Darüber hinaus möchten wir verstehen, wie sich eine Glykosylierungsstörung auf die Lipidzusammensetzung von Membranen auswirkt. Solche Veränderungen können eine negative Auswirkung auf eine Vielzahl an Vorgängen haben und zum Krankheitsbild der Glykosylierungsstörungen beitragen. Um diese Fragestellungen erfolgreich bearbeiten zu können, sind wir eng mit den anderen Projekten des Verbundes verzahnt.

Mehr Informationen zu Britta Brüggers Arbeitsgruppe auf ihrer Website.

Falk Büttner, Medizinische Hochschule Hannover

„Verwendung humaner Stammzellmodelle zur Charakterisierung von Glykosylierungsdefekten“

PMM2-CDG ist eine Erbkrankheit, die dazu führt, dass die Aktivität des Enzyms Phosphomannomutase 2 (PMM2) reduziert ist. Dieses Enzym wird jedoch benötigt, um bestimmte Zucker, sogenannte Glykane herstellen zu können, die dann an Proteine geheftet werden. Ohne diese Glykane sind manche Proteine nicht mehr richtig funktionsfähig und dadurch kommt es zur Ausprägung der typischen Erkrankungssymptome, wie frühkindliche Gedeihstörungen, ein Mangel an Muskelstärke sowie verzögerte körperliche, geistige und seelische Entwicklung.

Um besser verstehen zu können, welche Vorgänge während der frühsten Entwicklungsprozesse eines Kindes im Mutterleib fehlerhaft ablaufen, hat meine Arbeitsgruppe aus Hautzellen eines Patienten Stammzellen generiert. Mit diesen Stammzellen können wir nun die frühen Entwicklungsvorgänge nachahmen. Aus den Stammzellen können z.B. Nervenzellen oder Muskelzellen generiert werden, um dann an diesen Zelltypen eine Erklärung für die Symptome zu bekommen, die das Nervensystem oder die Muskeln der Patienten betreffen. Dabei werden wir uns wie eingangs erwähnt darauf fokussieren zu untersuchen, welche Proteine nicht mehr richtig funktionieren, weil ihnen der angeheftete Zucker (Glykan) fehlt. Da es verschiedene Klassen von Glykanen gibt, müssen wir diese getrennt untersuchen, um ihre individuellen Bedeutungen herauszufinden. Ein besonderer Schwerpunkt wird dabei auf der nur wenig untersuchten und als „C-Mannosylierung“ bezeichneten Form der Glykosylierung liegen.

Mehr Informationen zur Arbeitsgruppe von Falk Büttner auf seiner Website.

Erdmann Rapp, Max Planck Institut Magdeburg

„Untersuchung des Zusammenspiels ER-basierter Formen der Proteinglykosylierung mittels moderner Analyseverfahren, um CDG auf molekularer Ebene besser zu verstehen“

Proteine sind essentieller Bestandteil jeder Zelle und an praktisch allen biologischen Prozessen beteiligt. Viele Eigenschaften von Proteinen, wie deren Funktion und Stabilität, können durch zusätzlich angeknüpfte Zuckerstrukturen, sogenannte Glykane, beeinflusst werden. Im menschlichen Organismus gibt es eine Vielzahl solcher glykosylierter Proteine. Diese Glykoproteine können dabei unterschiedliche Typen der Glykosylierung tragen, d.h. die angeknüpften Glykane können von unterschiedlicher molekularer Gestalt sein und an unterschiedlichen Stellen innerhalb des Proteins auftreten.

Bei Patienten mit CDG können Gendefekte zu fehlerhaften Glykanen bzw. zu einer fehlerhaften oder ausbleibenden Ankopplung von Glykanen an die entsprechenden Zielproteine führen – man spricht dann von einer defekten Glykosylierung. Im Rahmen dieses Teilprojektes der DFG-Forschergruppe 2509 soll anhand ausgewählter Glykoproteine der Einfluss von Gendefekten auf die unterschiedlichen Glykosylierungstypen und damit auf das Krankheitsbild CDG untersucht werden. Dabei sollen vor allem mögliche Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Glykosylierungstypen aufgedeckt werden, z.B. ob/wie ein defektes Gen die unterschiedlichen Glykosylierungstypen beeinflusst. Die zu analysierenden Glykoproteine stammen dabei sowohl von CDG-Patienten, als auch aus Modellsystemen. Bei den Modellsystemen handelt es sich um Zellkulturen, sowie dem Modelorganismus Medaka, einem Fisch. In den Modellsystemen werden jeweils genetische Mutationen erzeugt welche dem Krankheitsbild CDG entsprechen. Die Untersuchung dieser Proteinproben erfolgt dabei mit Hilfe modernster Glykan- und Protein-Analysetechniken. Durch die so gewonnenen Erkenntnisse können in Zukunft hoffentlich neue CDG-Therapieansätze erarbeitet werden.

Mehr Informationen zur Arbeitsgruppe von Erdmann Rapp auf seiner Website.

Thomas Ruppert, Universität Heidelberg (ZMBH)

„Massenspektrometrische Bestimmung der exakten Mengen der an N-Glykosylierung beteiligten Enzyme in Zellen“

Im Rahmen dieses Projekts wird die Herstellung des Grundbausteins für den bekanntesten Glykosylierungsweg untersucht, für die N-Glykosylierung. Dieser Grundbaustein besteht aus vierzehn teilweise unterschiedlichen Zuckerbausteinen, die in exakt der richtigen Reihenfolge an exakt den richtigen Stellen miteinander verbunden werden müssen. Für diesen komplizierten Prozess sind 14 unterschiedliche Eiweiße (Enzyme) notwendig. Genmutationen in diesen Enzymen beeinträchtigen oder zerstören deren Funktion. Da der Grundbaustein nicht mehr korrekt hergestellt wird, funktioniert auch die N-Glykosylierung nicht oder nur teilweise. Es kommt zu den Symptomen der Krankheit.

Wir wollen eine Methode entwickeln, um die exakten Mengen der an diesem Prozess direkt beteiligten 14 Enzyme und weitere an Glylosylierungen beteiligten Eiweiße zu bestimmen. Die Kenntnis exakter Mengen in unterschiedlichen Zellen, Geweben oder Entwicklungsstadien von Zellen sollte zu neuen Erkenntnisse in folgenden Bereichen führen:

• Wie arbeiten diese 14 Enzyme in einer koordinierten Weise zusammen?
• Unterschiedliche Zellen wie zB. Leber- und Hautzellen mit unterschiedlichen Funktionen müssen unter anderem auch die Glykosylierungswege anpassen. Mit Kenntnis der genauen Mengen dieser Enzyme in unterschiedlichen Zellen erhalten wir Anhaltspunkte, wie eine Zelle diese koordinierte Funktion der 14 Enzyme verändert, um sie den neuen Anforderungen anzupassen.
• Was passiert auf molekularer Ebene, wenn eines dieser Enzyme in Folge einer Genmutation seine Funktion verliert?

Unsere Hoffnung ist, dass mit diesen Erkenntnissen bessere Therapiemöglichkeiten entwickelt werden können.

Mehr Informationen zur Arbeitsgruppe von Thomas Ruppert auf seiner Website.

Harald Schwalbe, Goethe-Universität Frankfurt

„Der Einfluss der Glykosylierung auf die Struktur, Funktion und Dynamik von Proteinen“

Obwohl mehr als die Hälfte aller menschlichen Proteine glykosyliert sind, versteht man die funktionellen Eigenschaften dieser wichtigen Modifikation bisher kaum, und strukturelle Informationen gibt es hierzu nur sehr selten. Die Untersuchung dieser Proteine ist schwierig, weil sie nicht in Bakterien auf einfache Weise hergestellt werden können. Hierfür werden komplizierte eukaryontische Expressionssysteme benötigt (wie Insektenzellen). Darüber hinaus sind die Größe, Flexibilität und Heterogenität dieser Proteine eine Herausforderung für die Analyse und deren Strukturbestimmung.

Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie wollen wir Informationen über die Veränderungen der Proteinstruktur und -dynamik bei der Glykosylierung erhalten, selbst in Fällen in denen das Zielprotein unstrukturiert ist oder mehrere Konformationen vorliegen. Dies erfordert die Entwicklung spezifischer Isotopenmarkierungsprotokolle für die Expression. Der erste Fokus liegt auf der C-Mannosylierung von Tryptophan-Resten in TSR1, dem Thrombospondin Typ 1-Repeat aus dem Netrin-Rezeptor UNC-5. Die zusätzliche Mannose beeinflusst zweifellos die Lokalisierung und Eigenschaften des Tryptophans und moduliert dadurch die Proteineigenschaften. Die Modifikation spielt möglicherweise eine Schlüsselrolle in der Funktion des Proteins. Es wird vermutet, dass Ligandenbindung, Rezeptorinternalisierung, korrekte Faltung, Export, Signaltransduktion und Zellmigration durch C-Mannosylierung beeinflusst werden. Unsere primären Untersuchungen können anschließend auf Glykosylierungs-Systeme erweitert werden.

Mehr Informationen zur Arbeitsgruppe von Harald Schwalbe auf seiner Website.

Irmgard Sinning, Universität Heidelberg (BZH)

„Strukturelle Grundlagen der Protein-O-Mannosylierung“

Glykosylierung von Membranproteinen und sekretorischen Proteinen ist die häufigste und vielfältigste post-translationale Modifikation, bei der Zuckermoleküle kovalent mit spezifischen Aminosäuren verknüpft werden. Die wichtigsten Vertreter sind die N- (Asparagin-verknüpfte) Glykosylierung und die O-Mannosylierung. Die Glykosylierung beeinflußt eine Vielzahl zellulärer Prozesse und ist evolutionär konserviert. In Hefe interferieren Defekte in der O-Mannosylierung mit der ER Homöostase, wohingegen erbliche-bedingte Störungen in der Glykosylierung (CDGs) im Menschen Wachstumsdefekte, Fehlentwicklungen und embryonale Sterblichkeit verursachen. Die Protein-O-Mannosyltransferasen (PMTs, POMTs) sind integrale Membranproteine des ER und katalysieren den Mannosyltransfer auf Serin und Threonin. Sie treten in vermutlich transiente Wechselwirkung mit dem Translokon und bilden Homo- und Heterodimere – aber ihre dreidimensionale Struktur ist bisher nicht bekannt.

Erstaunlicherweise ist ungeachtet der zentralen Bedeutung der O-Mannosylierung noch sehr wenig über ihre molekularen Mechanismen bekannt. Unser Ziel ist daher, die Struktur- und Funktionsanalyse der PMTs mittels eines integrativen strukturbiologischen Ansatzes.  Wir werden ihre Interaktion mit und Regulierung durch Lipide, sowie die Interaktion mit dem Translokon untersuchen, und eingebettet in diese Forschergruppe unsere detailierten strukturellen und biochemischen Ergebnisse zu einem übergreifenden Verständnis der O-Mannosylierung zusammenfügen. Ausserdem werden wir verschiedene ALG (asparagine-linked glycosylation) Proteine untersuchen, die an der Synthese der finalen Oligosaccharid-Verknüpfungen bei der N-Glykosylierung beteiligt sind. Unsere Untersuchungen sollen letztlich zeigen, wie Mutationen in CDG-Patienten die enzymatische Kaskade beeinflussen.

Mehr Informationen zur Arbeitsgruppe von Irmgard Sinning auf ihrer Website.

Sabine Strahl, Universität Heidelberg (COS)

„Protein O-Mannosylierung und ihre Verzahnung mit der N-Glykosylierung“

Eiweiße (sog. Proteine) können mit sehr unterschiedlichen Typen von Zuckerketten verknüpft sein. Solche unterschiedlichen Glykosylierungstypen sind die O-Mannosylierung und die N-Glykosylierung, die essentiell für das Wachstum und die Entwicklung von Tieren und Menschen sind. Defekte beider Glykosylierungstypen führen zu schweren Krankheiten, den “Congenital Disorders of Glycosylation“ (CDG).

N-Glykosylierung und O-Mannosylierung können auf den selben Proteinen vorkommen, wie z.B. den Cadherinen, die für den Zusammenhalt von Zellen wichtig sind. Unsere Arbeiten der letzten Jahre haben gezeigt, dass die Hemmung der O-Mannosylierung im Säuger die Funktion von Cadherinen beeinträchtigt. Unerwarteterweise geht dies mit der Veränderung der N-Glykosylierung dieser wichtigen Moleküle einher. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Wechselwirkung sind unbekannt.

Um diesen Fragen nachzugehen, wollen wir die O-Mannosylierung in Säugern und Ihren Bezug zur N-Glykosylierung untersuchen. Unsere Untersuchungen werden zu einem umfassenden Verständnis sowohl des Ablaufs der der O-Mannosylierung als auch der unterschiedlichen Auswirkungen von O-Mannosylierungsdefekten führen und eine gezieltere Analyse der Fehlbildungen von CDG Modellen ermöglichen.

Mehr Informationen zur Arbeitsgruppe von Sabine Strahl auf ihrer Website.

Christian Thiel, Universitätsklinikum Heidelberg

„Komplexbildung und pathologische Mechanismen in den frühen Schritten des N-Glykosylierungswegs“

`Congenital Disorders of Glycosylation´ (CDG) umfassen mittlerweile mehr als 100 verschiedene Erberkrankungen innerhalb der Glykokonjugatbiosynthese des Menschen. In den letzten Jahren haben wir eine Vielzahl an Patienten identifiziert, die von einem der frühen Glykosylierungsdefekte auf der cytosolischen Seite des endoplasmatischen Retikulums betroffen sind und einen schweren klinischen Phänotyp aufweisen. Aktuell fehlen noch immer tiefergehende Studien bezüglich regulatorischer Mechanismen bei N-Glykosylierungsdefizienz. Unser Projekt zielt darauf ab, die pathophysiologischen Zusammenhänge zwischen den ALG1-, ALG2- und ALG11-Mannosyltransferasen in den frühen Schritten der N-Glykosylierung zu untersuchen und die Auswirkungen ihrer reduzierten Funktionalität auf andere Glykosylierungswege mit Hilfe von Zell- und Tiermodellen zu studieren, wobei ein Fokus auf der bifunktionellen ALG2-Mannosyltransferase liegen wird.

Neben Untersuchungen zu einem möglichen Mannosyltransferasekomplex werden wir auch  untersuchen, wie sich Fehlfunktionen der Mannosyltransferasen auf die Zusammensetzung der drei  N-Glykantypen auswirkt und nachfolgend potenziell auch O- und C-Mannosylierung, sowie O-Fucosylierung beeinflusst. Weiterhin sollen verkürzte ALG2-Proteine auf ihre α1,6-Mannosyl- transferaseaktivität hin überprüft werden. Zudem sollen in einem Medaka-Modell Alg2-abhängige Prozesse insbesondere im Hinblick auf die Embryonalentwicklung studiert werden.

Mehr Informationen zur Arbeitsgruppe von Christian Thiel auf seiner Website.

Thomas Thumberger, Joachim Wittbrodt, Universität Heidelberg (COS)

„Die Bedeutung der Proteinglykosylierung innerhalb des ER für die Neuronalentwicklung von Wirbeltieren“

Die Wahrnehmung der extrazellulären Umgebung ist insbesondere für die Entwicklung des Nervensystems von herausragender Bedeutung. Schlüsselereignisse in der Neuralentwicklung, wie die Musterbildung in der Neuralplatte oder das Auswachsen von Axonen hängen maßgeblich von Proteininteraktionen an Zelloberflächen ab. Extrazelluläre Oberflächenproteine sind durch N-Glykosylierung sowie C- und O-Mannosylierung oder Kombinationen daraus essentiell modifiziert. Als Konsequenz resultieren Fehler in der Glykosylierung bei Patienten unter anderem in schweren Defekten der Neuralentwicklung und neuronaler Funktionalität. Fischmodelle bieten alternative Wege, um die genaue Rolle der Glykosylierung während der Neuralentwicklung zu untersuchen. Die natürliche Entwicklung der Fischembryonen außerhalb der Mutter erlaubt es, Phänotypen bereits in den frühesten Stadien der Embryonalentwicklung zu erkennen und zu analysieren.

Unter Ausnutzung der CRISPR/Cas9 vermittelten Genommodifiaktion werden wir Fischmodelle etablieren, die die detaillierte molekulare Analyse von menschlichen Syndromen erlauben. Wir fokussieren uns auf klare Effekte im Auge, das als Modell für komplexe neurale Strukturen steht. Das lebenslange Wachstum der Fische erlaubt weiterhin die kontinuierliche Analyse der Rolle von Glyko-Modifikationen während der lebenslangen Neurogenese in der Netzhaut. Wir werden zudem unsere Erfahrung in der Genomeditierung nutzen, um die Schlüsselfaktoren der Glykosylierung zu inaktivieren, und anstelle dieser Faktoren von der Zelle ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) generieren zu lassen. Die von uns etablierten Modelle liefern den organismischen Kontext für die strukturbiologischen, biochemischen, molekular- und zellbiologischen Untersuchungen, die mit den Partnern in der Forschergruppe in enger Abstimmung durchgeführt werden.

Mehr Informationen zur Arbeitsgruppe von Joachim Wittbrodt auf seiner Website.